Javascript er for øyeblikket deaktivert i nettleseren din. Når javascript er deaktivert, vil ikke enkelte funksjoner på dette nettstedet fungere.
Registrer dine spesifikke opplysninger og spesifikke legemidler du er interessert i, så matcher vi informasjonen du oppgir med artikler i vår omfattende database og sender deg en PDF-kopi via e-post innen rimelig tid.
Kontroller bevegelsen av magnetiske jernoksid-nanopartikler for målrettet levering av cytostatika
Forfatter Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitrij Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov nasjonale medisinske forskningssenter under Helsedepartementet i Den russiske føderasjon, St. Petersburg, 197341, Russland; 2 St. Petersburg elektrotekniske universitet «LETI», St. Petersburg, 197376, Russland; 3 Senter for personlig tilpasset medisin, Almazov statlige medisinske forskningssenter, Helsedepartementet i Den russiske føderasjon, St. Petersburg, 197341, Russland; 4FSBI «Institutt for influensaforskning oppkalt etter A.A. Smorodintsev» Helsedepartementet i Den russiske føderasjon, St. Petersburg, Russland; 5 Sechenov-instituttet for evolusjonær fysiologi og biokjemi, Det russiske vitenskapsakademiet, St. Petersburg, Russland; 6 RAS Institutt for cytologi, St. Petersburg, 194064, Russland; 7INSERM U1231, Fakultet for medisin og farmasi, Bourgogne-Franche Comté Universitetet i Dijon, Frankrike Kommunikasjon: Yana ToropovaAlmazov Nasjonalt medisinsk forskningssenter, Helsedepartementet i Russland, Saint-Petersburg, 197341, Russland Tlf. +7 981 95264800 4997069 E-post [email protected] Bakgrunn: En lovende tilnærming til problemet med cytostatisk toksisitet er bruken av magnetiske nanopartikler (MNP) for målrettet medikamentlevering. Formål: Å bruke beregninger for å bestemme de beste egenskapene til magnetfeltet som kontrollerer MNP-er in vivo, og å evaluere effektiviteten av magnetronlevering av MNP-er til musesvulster in vitro og in vivo. (MNPs-ICG) brukes. In vivo luminescensintensitetsstudier ble utført på tumormus, med og uten et magnetfelt på det aktuelle stedet. Disse studiene ble utført på et hydrodynamisk stillas utviklet av Institutt for eksperimentell medisin ved Almazov statlige medisinske forskningssenter i det russiske helsedepartementet. Resultat: Bruk av neodymmagneter fremmet selektiv akkumulering av MNP. Ett minutt etter administrering av MNPs-ICG til tumorbærende mus, akkumuleres MNPs-ICG hovedsakelig i leveren. I fravær og nærvær av et magnetfelt indikerer dette dens metabolske vei. Selv om en økning i fluorescensen i svulsten ble observert i nærvær av et magnetfelt, endret ikke fluorescensintensiteten i dyrets lever seg over tid. Konklusjon: Denne typen MNP, kombinert med den beregnede magnetfeltstyrken, kan være grunnlaget for utvikling av magnetisk kontrollert tilførsel av cytostatika til tumorvev. Nøkkelord: fluorescensanalyse, indocyanin, jernoksid-nanopartikler, magnetrontilførsel av cytostatika, tumormålretting.
Tumorsykdommer er en av hovedårsakene til død på verdensbasis. Samtidig eksisterer dynamikken med økende sykelighet og dødelighet av tumorsykdommer fortsatt.1 Kjemoterapi som brukes i dag er fortsatt en av de viktigste behandlingene for ulike svulster. Samtidig er utviklingen av metoder for å redusere den systemiske toksisiteten til cytostatika fortsatt relevant. En lovende metode for å løse toksisitetsproblemet er å bruke nanoskalabærere for å målrette legemiddelleveringsmetoder, som kan gi lokal akkumulering av legemidler i tumorvev uten å øke konsentrasjonen av dem i friske organer og vev.2 Denne metoden gjør det mulig å forbedre effektiviteten og målrettingen av cellegift på tumorvev, samtidig som den systemiske toksisiteten reduseres.
Blant de ulike nanopartiklene som vurderes for målrettet levering av cytostatika, er magnetiske nanopartikler (MNP) av spesiell interesse på grunn av deres unike kjemiske, biologiske og magnetiske egenskaper, som sikrer deres allsidighet. Derfor kan magnetiske nanopartikler brukes som et varmesystem for å behandle svulster med hypertermi (magnetisk hypertermi). De kan også brukes som diagnostiske midler (magnetisk resonansdiagnose). 3-5 Ved å bruke disse egenskapene, kombinert med muligheten for MNP-akkumulering i et bestemt område, gjennom bruk av et eksternt magnetfelt, åpner levering av målrettede farmasøytiske preparater for etableringen av et multifunksjonelt magnetronsystem for å målrette cytostatika mot tumorstedet. Et slikt system vil inkludere MNP og magnetfelt for å kontrollere deres bevegelse i kroppen. I dette tilfellet kan både eksterne magnetfelt og magnetiske implantater plassert i kroppsområdet som inneholder svulsten brukes som kilde til magnetfeltet. 6 Den første metoden har alvorlige mangler, inkludert behovet for å bruke spesialisert utstyr for magnetisk målretting av legemidler og behovet for å trene personell til å utføre kirurgi. I tillegg er denne metoden begrenset av høye kostnader og er kun egnet for «overfladiske» svulster nær kroppens overflate. Den alternative metoden med bruk av magnetiske implantater utvider anvendelsesområdet for denne teknologien, og forenkler bruken på svulster lokalisert i forskjellige deler av kroppen. Både individuelle magneter og magneter integrert i den intraluminale stenten kan brukes som implantater for svulstskader i hule organer for å sikre deres åpenhet. I følge vår egen upubliserte forskning er disse imidlertid ikke tilstrekkelig magnetiske til å sikre retensjon av MNP fra blodomløpet.
Effektiviteten av magnetronmedisinlevering avhenger av mange faktorer: egenskapene til selve den magnetiske bæreren og egenskapene til magnetfeltkilden (inkludert de geometriske parametrene til permanentmagneter og styrken til magnetfeltet de genererer). Utviklingen av vellykket magnetisk styrt cellehemmerleveringsteknologi bør innebære utvikling av passende magnetiske nanoskala-legemiddelbærere, vurdering av deres sikkerhet og utvikling av en visualiseringsprotokoll som gjør det mulig å spore bevegelsene deres i kroppen.
I denne studien beregnet vi matematisk de optimale magnetfeltegenskapene for å kontrollere den magnetiske nanoskala-legemiddelbæreren i kroppen. Muligheten for å beholde MNP gjennom blodåreveggen under påvirkning av et påført magnetfelt med disse beregningsmessige egenskapene ble også studert i isolerte rotteblodkar. I tillegg syntetiserte vi konjugater av MNP-er og fluorescerende stoffer og utviklet en protokoll for visualisering av dem in vivo. Under in vivo-forhold, i tumormodellmus, ble akkumuleringseffektiviteten av MNP-er i tumorvev når de administreres systemisk under påvirkning av et magnetfelt studert.
I in vitro-studien brukte vi referanse-MNP-en, og i in vivo-studien brukte vi MNP-en belagt med melkesyrepolyester (polymelkesyre, PLA) som inneholdt et fluorescerende middel (indolecyanin; ICG). MNP-ICG er inkludert i. I tilfellet, bruk (MNP-PLA-EDA-ICG).
Syntesen og de fysiske og kjemiske egenskapene til MNP er beskrevet i detalj andre steder.7,8
For å syntetisere MNP-ICG ble PLA-ICG-konjugater først produsert. En racemisk pulverblanding av PLA-D og PLA-L med en molekylvekt på 60 kDa ble brukt.
Siden PLA og ICG begge er syrer, må man først syntetisere en aminoterminert spacer på PLA for å kunne syntetisere PLA-ICG-konjugater, noe som hjelper ICG med å kjemisorbere til spaceren. Spaceren ble syntetisert ved hjelp av etylendiamin (EDA), karbodiimidmetoden og vannløselig karbodiimid, 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC). PLA-EDA-spaceren syntetiseres som følger. Tilsett 20 ganger molart overskudd av EDA og 20 ganger molart overskudd av EDAC til 2 ml 0,1 g/ml PLA-kloroformløsning. Syntesen ble utført i et 15 ml polypropylen-reagensrør på en ristemaskin med en hastighet på 300 min-1 i 2 timer. Synteseskjemaet er vist i figur 1. Gjenta syntesen med et 200 ganger overskudd av reagenser for å optimalisere synteseskjemaet.
Ved slutten av syntesen ble løsningen sentrifugert med en hastighet på 3000 min-1 i 5 minutter for å fjerne overflødig utfelt polyetylenderivat. Deretter ble 2 ml av en 0,5 mg/ml ICG-løsning i dimetylsulfoksid (DMSO) tilsatt til 2 ml-løsningen. Omrøreren fikseres ved en omrøringshastighet på 300 min-1 i 2 timer. Det skjematiske diagrammet av det oppnådde konjugatet er vist i figur 2.
I 200 mg MNP tilsatte vi 4 ml PLA-EDA-ICG-konjugat. Bruk en LS-220-rister (LOIP, Russland) til å omrøre suspensjonen i 30 minutter med en frekvens på 300 min-1. Deretter ble den vasket med isopropanol tre ganger og utsatt for magnetisk separasjon. Bruk UZD-2 Ultrasonic Disperser (FSUE NII TVCH, Russland) til å tilsette IPA til suspensjonen i 5–10 minutter under kontinuerlig ultralydpåvirkning. Etter den tredje IPA-vasken ble bunnfallet vasket med destillert vann og resuspendert i fysiologisk saltvann med en konsentrasjon på 2 mg/ml.
ZetaSizer Ultra-utstyret (Malvern Instruments, Storbritannia) ble brukt til å studere størrelsesfordelingen til den oppnådde MNP-en i den vandige løsningen. Et transmisjonselektronmikroskop (TEM) med en JEM-1400 STEM-feltemisjonskatode (JEOL, Japan) ble brukt til å studere formen og størrelsen på MNP-en.
I denne studien bruker vi sylindriske permanentmagneter (kvalitet N35; med nikkelbeskyttende belegg) og følgende standardstørrelser (lang akselengde × sylinderdiameter): 0,5 × 2 mm, 2 × 2 mm, 3 × 2 mm og 5 × 2 mm.
In vitro-studien av MNP-transport i modellsystemet ble utført på et hydrodynamisk stillas utviklet av Institutt for eksperimentell medisin ved Almazov statlige medisinske forskningssenter i det russiske helsedepartementet. Volumet av den sirkulerende væsken (destillert vann eller Krebs-Henseleit-løsning) er 225 ml. Aksialt magnetiserte sylindriske magneter brukes som permanentmagneter. Plasser magneten på en holder 1,5 mm fra den indre veggen av det sentrale glassrøret, med enden vendt mot rørets retning (vertikal). Væskestrømningshastigheten i den lukkede sløyfen er 60 l/t (tilsvarende en lineær hastighet på 0,225 m/s). Krebs-Henseleit-løsning brukes som en sirkulerende væske fordi den er en analog av plasma. Den dynamiske viskositetskoeffisienten til plasma er 1,1–1,3 mPa∙s. 9 Mengden MNP som adsorberes i magnetfeltet bestemmes ved spektrofotometri fra konsentrasjonen av jern i den sirkulerende væsken etter eksperimentet.
I tillegg er det utført eksperimentelle studier på et forbedret fluidmekanikkbord for å bestemme den relative permeabiliteten til blodårene. Hovedkomponentene i den hydrodynamiske støtten er vist i figur 3. Hovedkomponentene i den hydrodynamiske stenten er en lukket sløyfe som simulerer tverrsnittet av modellens vaskulære system og en lagringstank. Bevegelsen av modellvæsken langs konturen av blodåremodulen tilveiebringes av en peristaltisk pumpe. Under eksperimentet må fordampningen og det nødvendige temperaturområdet opprettholdes, og systemparametrene (temperatur, trykk, væskestrømningshastighet og pH-verdi) overvåkes.
Figur 3 Blokkdiagram av oppsettet som brukes til å studere permeabiliteten til halspulsåreveggen. 1-lagringstank, 2-peristaltisk pumpe, 3-mekanisme for å innføre suspensjon som inneholder MNP i sløyfen, 4-strømningsmåler, 5-trykksensor i sløyfen, 6-varmeveksler, 7-kammer med beholder, 8-kilden til magnetfeltet, 9-ballongen med hydrokarboner.
Kammeret som inneholder beholderen består av tre beholdere: en ytre stor beholder og to små beholdere, som armene til den sentrale kretsen passerer gjennom. Kanylen settes inn i den lille beholderen, beholderen er festet til den lille beholderen, og spissen av kanylen er tett bundet med en tynn ståltråd. Rommet mellom den store beholderen og den lille beholderen er fylt med destillert vann, og temperaturen forblir konstant på grunn av tilkoblingen til varmeveksleren. Rommet i den lille beholderen er fylt med Krebs-Henseleit-løsning for å opprettholde levedyktigheten til blodårecellene. Tanken er også fylt med Krebs-Henseleit-løsning. Gassforsyningssystemet (karbon) brukes til å fordampe løsningen i den lille beholderen i lagringstanken og kammeret som inneholder beholderen (figur 4).
Figur 4 Kammeret der beholderen er plassert. 1-Kanyle for senking av blodårer, 2-Ytre kammer, 3-Lite kammer. Pilen indikerer retningen på modellvæsken.
For å bestemme den relative permeabilitetsindeksen til karveggen ble rottehalspulsåren brukt.
Innføringen av MNP-suspensjon (0,5 ml) i systemet har følgende egenskaper: det totale indre volumet til tanken og tilkoblingsrøret i sløyfen er 20 ml, og det indre volumet til hvert kammer er 120 ml. Den eksterne magnetfeltkilden er en permanentmagnet med en standardstørrelse på 2 × 3 mm. Den er installert over et av de små kamrene, 1 cm fra beholderen, med den ene enden vendt mot beholderveggen. Temperaturen holdes på 37 °C. Effekten til rullepumpen er satt til 50 %, noe som tilsvarer en hastighet på 17 cm/s. Som kontroll ble det tatt prøver i en celle uten permanentmagneter.
En time etter administrering av en gitt konsentrasjon av MNP ble det tatt en væskeprøve fra kammeret. Partikkelkonsentrasjonen ble målt med et spektrofotometer ved bruk av Unico 2802S UV-Vis-spektrofotometer (United Products & Instruments, USA). Med tanke på absorpsjonsspekteret til MNP-suspensjonen ble målingen utført ved 450 nm.
I henhold til Rus-LASA-FELASA-retningslinjene oppdrettes alle dyr i spesifikke patogenfrie anlegg. Denne studien overholder alle relevante etiske regler for dyreforsøk og forskning, og har fått etisk godkjenning fra Almazov National Medical Research Center (IACUC). Dyrene drakk vann ad libitum og fikk regelmessig mat.
Studien ble utført på 10 bedøvede 12 uker gamle hannmus med immunsvikt av typen NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA)10, som veide 22 g ± 10 %. Siden immuniteten til immunsviktmus er undertrykt, tillater immunsviktmusene i denne linjen transplantasjon av humane celler og vev uten avstøting av transplantatet. Kullsønnene fra forskjellige bur ble tilfeldig tildelt forsøksgruppen, og de ble avlet i samme kull eller systematisk eksponert for sengetøy fra andre grupper for å sikre lik eksponering for den felles mikrobiotaen.
HeLa-cellelinjen for humane kreft brukes til å etablere en xenograftmodell. Cellene ble dyrket i DMEM som inneholdt glutamin (PanEco, Russland), tilsatt 10 % føtalt bovint serum (Hyclone, USA), 100 CFU/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Cellelinjen ble vennligst levert av Gene Expression Regulation Laboratory ved Institute of Cell Research ved det russiske vitenskapsakademiet. Før injeksjon ble HeLa-celler fjernet fra kulturplasten med en 1:1 trypsin:Versene-løsning (Biolot, Russland). Etter vask ble cellene suspendert i komplett medium til en konsentrasjon på 5 × 106 celler per 200 μl, og fortynnet med basalmembranmatrise (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, på is). Den fremstilte cellesuspensjonen ble injisert subkutant i huden på muselåret. Bruk elektroniske skyvelære for å overvåke tumorvekst hver tredje dag.
Da svulsten nådde 500 mm3, ble en permanentmagnet implantert i muskelvevet til forsøksdyret nær svulsten. I forsøksgruppen (MNP-er-ICG + svulst-M) ble 0,1 ml MNP-suspensjon injisert og eksponert for et magnetfelt. Ubehandlede hele dyr ble brukt som kontroll (bakgrunn). I tillegg ble det brukt dyr injisert med 0,1 ml MNP, men ikke implantert med magneter (MNP-ICG + svulst-BM).
Fluorescensvisualisering av in vivo- og in vitro-prøver ble utført på IVIS Lumina LT serie III bioimager (PerkinElmer Inc., USA). For in vitro-visualisering ble et volum på 1 ml syntetisk PLA-EDA-ICG- og MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat tilsatt platebrønnene. Med tanke på fluorescensegenskapene til ICG-fargestoffet velges det beste filteret som brukes til å bestemme lysintensiteten til prøven: maksimal eksitasjonsbølgelengde er 745 nm, og emisjonsbølgelengden er 815 nm. Living Image 4.5.5-programvaren (PerkinElmer Inc.) ble brukt til å kvantitativt måle fluorescensintensiteten til brønnene som inneholder konjugatet.
Fluorescensintensiteten og akkumuleringen av MNP-PLA-EDA-ICG-konjugatet ble målt i in vivo tumormodellmus, uten tilstedeværelse og påføring av et magnetfelt på det aktuelle stedet. Musene ble bedøvet med isofluran, og deretter ble 0,1 ml MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat injisert gjennom halevenen. Ubehandlede mus ble brukt som negativ kontroll for å oppnå en fluorescerende bakgrunn. Etter intravenøs administrering av konjugatet, plasseres dyret på et varmeplattform (37 °C) i kammeret til IVIS Lumina LT serie III fluorescensbildekamera (PerkinElmer Inc.) mens inhalasjon opprettholdes med 2 % isofluranbedøvelse. Bruk ICGs innebygde filter (745–815 nm) for signaldeteksjon 1 minutt og 15 minutter etter introduksjonen av MNP.
For å vurdere akkumuleringen av konjugat i svulsten ble dyrets peritoneale område dekket med papir, noe som gjorde det mulig å eliminere den sterke fluorescensen assosiert med akkumulering av partikler i leveren. Etter å ha studert biodistribusjonen av MNP-PLA-EDA-ICG ble dyrene humant avlivet ved en overdose isoflurananestesi for påfølgende separasjon av svulstområder og kvantitativ vurdering av fluorescensstråling. Bruk Living Image 4.5.5-programvaren (PerkinElmer Inc.) til å manuelt behandle signalanalysen fra det valgte interesseområdet. Tre målinger ble tatt for hvert dyr (n = 9).
I denne studien kvantifiserte vi ikke den vellykkede belastningen av ICG på MNP-ICG. I tillegg sammenlignet vi ikke retensjonseffektiviteten til nanopartikler under påvirkning av permanentmagneter i forskjellige former. I tillegg evaluerte vi ikke den langsiktige effekten av magnetfeltet på retensjonen av nanopartikler i tumorvev.
Nanopartikler dominerer, med en gjennomsnittlig størrelse på 195,4 nm. I tillegg inneholdt suspensjonen agglomerater med en gjennomsnittlig størrelse på 1176,0 nm (figur 5A). Deretter ble delen filtrert gjennom et sentrifugalfilter. Partiklenes zetapotensial er -15,69 mV (figur 5B).
Figur 5 Suspensjonens fysiske egenskaper: (A) partikkelstørrelsesfordeling; (B) partikkelfordeling ved zetapotensial; (C) TEM-fotografi av nanopartikler.
Partikkelstørrelsen er i utgangspunktet 200 nm (figur 5C), bestående av en enkelt MNP med en størrelse på 20 nm, og et PLA-EDA-ICG-konjugert organisk skall med lavere elektrontetthet. Dannelsen av agglomerater i vandige løsninger kan forklares med den relativt lave modulen til den elektromotoriske kraften til individuelle nanopartikler.
For permanente magneter, når magnetiseringen er konsentrert i volumet V, deles integraluttrykket inn i to integraler, nemlig volumet og overflaten:
I tilfelle av en prøve med konstant magnetisering er strømtettheten null. Da vil uttrykket for den magnetiske induksjonsvektoren ha følgende form:
Bruk MATLAB-programmet (MathWorks, Inc., USA) for numerisk beregning, ETU «LETI» akademisk lisensnummer 40502181.
Som vist i figur 7 figur 8 figur 9 figur-10, genereres det sterkeste magnetfeltet av en magnet som er orientert aksialt fra enden av sylinderen. Den effektive aksjonsradiusen tilsvarer magnetens geometri. I sylindriske magneter med en sylinder hvis lengde er større enn diameteren, observeres det sterkeste magnetfeltet i aksial-radial retning (for den tilsvarende komponenten); derfor er et par sylindere med et større sideforhold (diameter og lengde) MNP-adsorpsjon den mest effektive.
Fig. 7 Komponenten av den magnetiske induksjonsintensiteten Bz langs magnetens Oz-akse; standardstørrelsen på magneten: svart linje 0,5 × 2 mm, blå linje 2 × 2 mm, grønn linje 3 × 2 mm, rød linje 5 × 2 mm.
Figur 8 Den magnetiske induksjonskomponenten Br er vinkelrett på magnetaksen Oz; standardstørrelsen på magneten: svart linje 0,5 × 2 mm, blå linje 2 × 2 mm, grønn linje 3 × 2 mm, rød linje 5 × 2 mm.
Figur 9 Den magnetiske induksjonsintensiteten Bz-komponenten i avstanden r fra magnetens endeakse (z=0); standardstørrelsen på magneten: svart linje 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grønn linje 3×2 mm, rød linje 5×2 mm.
Figur 10 Magnetisk induksjonskomponent langs radial retning; standard magnetstørrelse: svart linje 0,5 × 2 mm, blå linje 2 × 2 mm, grønn linje 3 × 2 mm, rød linje 5 × 2 mm.
Spesielle hydrodynamiske modeller kan brukes til å studere metoden for MNP-levering til tumorvev, konsentrere nanopartikler i målområdet og bestemme nanopartiklers oppførsel under hydrodynamiske forhold i sirkulasjonssystemet. Permanente magneter kan brukes som eksterne magnetfelt. Hvis vi ignorerer den magnetostatiske interaksjonen mellom nanopartiklene og ikke tar hensyn til den magnetiske væskemodellen, er det tilstrekkelig å estimere interaksjonen mellom magneten og en enkelt nanopartikkel med en dipol-dipol-tilnærming.
Der m er magnetens magnetiske moment, r er radiusvektoren til punktet der nanopartikkelen befinner seg, og k er systemfaktoren. I dipoltilnærmingen har magnetens felt en lignende konfigurasjon (figur 11).
I et jevnt magnetfelt roterer nanopartiklene bare langs kraftlinjene. I et ikke-jevnt magnetfelt virker kraften på dem:
Hvor er den deriverte av en gitt retning l. I tillegg trekker kraften nanopartiklene inn i de mest ujevne områdene av feltet, det vil si at krumningen og tettheten av kraftlinjene øker.
Derfor er det ønskelig å bruke en tilstrekkelig sterk magnet (eller magnetkjede) med tydelig aksial anisotropi i området der partiklene befinner seg.
Tabell 1 viser evnen til en enkelt magnet som en tilstrekkelig magnetfeltkilde til å fange opp og holde på MNP i det vaskulære laget av applikasjonsfeltet.